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荧光显微镜及其使用

作者: 发布人:王甫荣 发布时间:2019-04-27 20:45:26 阅读(15 1.00

试题研究:和毕业的学生聊天时发现,她在使用荧光蛋白进行实验,用到了水母蛋白完成实验。


荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。


一、使用方法


荧光显微镜也是光学显微镜的一种,主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。


1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上;


2.光源为紫外光,波长较短,分辨力率高于普通显微镜;


3.有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人眼。


二、主要用途


荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。


三、关于荧光蛋白


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通过荧光显微镜观察到细胞内标记的荧光蛋白


最早出现的绿色荧光蛋白(GFP)是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现,之后又在海洋珊瑚虫中分离得到了第二种GFP。


水母GFP是由238氨基酸组成的单体蛋白质,分子量约27KD,GFP荧光的产生主要是在氧气存在下,分子内第67位的甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基,第66位酪氨酸的α-2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,这样GFP分子中就形成对羧基苯甲酸唑环酮生色团发出荧光。


在搞清楚了这一原理后,GFP被广泛的应用到生物学研究中了,各个厂家如Promega公司、Stratagene公司(包括来自香港中文大学的橙色蛋白制备技术)、Clontech公司(现属Takara公司)等都出产了相应的产品。


但此前穿透性最强的荧光蛋白质也不能帮助研究者看到活体生物体皮下更深层的状况。现在,随着俄罗斯科学院的Dmitriy Chudakov最近培育出穿透性极强的深红色荧光蛋白质,利用荧光蛋白质进行的生物研究领域将出现重大突破。


2008年,美籍华裔科学家钱永健,因研究绿色荧光蛋白方面的突出贡献而获诺贝尔奖。


链接:解读2014年诺贝尔化学奖——超分辨率荧光显微技术


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